En esta edición de CALILAB en el Área de Genética y Genómica se desarrollarán conferencias y simposios referidos a la aplicación de la biopsia líquida en el campo de la oncología clínica.

FABAinforma entrevistó a Mariano Golubicki, un joven bioquímico que se desempeña en el Laboratorio de Biología Molecular de la Unidad de Investigación Traslacional – GENUIT del Hospital de Gastroenterología "Dr Carlos B. Udaondo" de CABA, quien participará por primera vez en CALILAB con este tema de su especialidad.

¿Es la primera vez que participa como coordinador y disertante en el área de Genética y Genómica en CALILAB?

Si, es la primera vez que participo como coordinador y disertante en el área de genética y genómica en CALILAB. Encantado de participar para poder discutir con la audiencia las aplicaciones y futuras perspectivas de esta nueva tecnología sobre cómo puede ayudar la biopsia líquida a tomar decisiones en aplicaciones clínicas sobre tumores sólidos y más aún en tumores gastrointestinales.

¿Qué opinión le merece este evento que organiza la Fundación Bioquímica Argentina?

Me parece un evento de relevancia y trascendencia donde actores importantes de la salud argentina se encuentran para discutir temas centrales de innovación y desarrollo.

¿Qué otros centros en el país, además del Hospital de Gastroenterología "Dr Carlos B. Udaondo" donde usted se desempeña, cuentan con Laboratorios de Biología Molecular con capacidad para resolver biomarcadores tumorales por la técnica de biopsia líquida?

Hay muchos laboratorios en el país con capacidad de resolver este tipo de técnica en el mediano plazo, es cuestión de tiempo. En nuestro laboratorio estamos en instancias de investigación para desarrollar un panel de secuenciación de NGS sobre cfDNA y poder detectar variantes y biomarcadores con el objetivo de mejorar la selección de tratamientos de primera línea del cáncer colorrectal metastásico.

¿Esta tecnología de biopsia líquida se utiliza en nuestro país en la práctica clínica o solo queda restringida al campo de la investigación?

Como introducción ya que será parte del simposio en el congreso de CALILAB de este año, la biopsia líquida es un campo bastante grande que tiene distintas aristas y distintas aplicaciones. Para aclarar la terminología hablamos de cfDNA o cell-free DNA a todo el ADN que se extrae de una muestra de plasma, por eso lo llamamos "libre de células". Luego cuando detectamos mutaciones o variantes que sabemos que pueden venir del tumor hablamos de ctDNA o circulating-tumor DNA. Por ende el ctDNA es una fracción del cfDNA.

La biopsia líquida abarca desde la detección temprana del cáncer en el concepto denominado Multi Cancer Early Detection (MCED) donde con una muestra de sangre periférica podríamos detectar si un paciente está comenzando a desarrollar cáncer hasta información acerca del pronóstico y respuesta a los tratamientos oncológicos ya sean dirigidos a dianas específicas o no. La indicación para un test de detección temprana no sería indicada por un oncólogo sino que por un médico clínico en etapas de prevención, de la misma manera en la cual se indica un chequeo general. En general sobre este campo de detección temprano del cáncer los desarrollos pueden estar basados en perfiles de ADN metilados, o en perfiles micro ARNs o en combinaciones de estas macromoléculas y sus modificaciones.

Por otra parte, están las instancias posteriores al diagnóstico del cáncer donde la biopsia líquida puede tener otro rol. Dentro de estas opciones podemos hablar de tres grandes grupos de biopsias líquidas: uno el cual llamamos "Sin información previa de las variantes tumorales" (tumor uninformed) en donde no conocemos ninguna alteración de manera previa a nivel del ADN en el tumor y por ende tenemos que secuenciar a través de tecnología de NGS (Next Generation Sequencing) para saber cuál es el perfil de mutaciones que compone esa muestra en ese momento determinado y que luego vamos a querer monitorear. La tecnología NGS implica tener conocimientos para poder implementar pipelines de análisis bioinformáticos en servidores o computadoras con capacidad de procesar un gran volumen de datos. Esto no es habitual en los laboratorios con perfiles clínicos aún. Pero sí en laboratorios de investigación como es nuestro caso.

Luego está el grupo de las biopsias líquidas que llamamos "Con información previa" (tumor informed) en esta instancia donde conocemos previamente alguna alteración que queremos detectar ya sea para evaluar la respuesta al tratamiento (que puede ser mediante el seguimiento o monitoreo con varias determinaciones seriadas) o para el pronóstico antes de iniciarlo, aquí el desarrollo es más sencillo y más accesible ya que podemos diseñar un sonda (probe) para que detecte específicamente la variante previamente reportada, ya sea por un estudio previo de "tumor uninformed" de biopsia líquida, por un estudio previo en una muestra de tejido parafinado lo que es habitual en la práctica o por lo reportado en la bibliografía. Estas sondas pueden ser detectadas por un equipo de PCR (polymerase chain reaction) que puede ser de digital droplet PCR o real time PCR. La digital droplet PCR en general reporta mayor sensibilidad.

Por último, el grupo restante es al que llamamos detección de enfermedad residual, siempre hablando de tumores sólidos, hoy llamado MRD por "molecular residual disease" o "minimal residual disease" en donde en general través de la detección de alguna macromolécula (ADN o ARN metilado, o microARN, o también variantes somáticas de ADN) a una muy alta sensibilidad podemos inferir, de resultar positiva la detección, una recaída tumoral o nueva aparición de lesiones e intensificar tratamientos anticipándonos bastante tiempo antes que lo que lo haría un estudio imagenológico. O bien, tomar decisiones de no tratar con quimioterapia adyuvante post cirugía en el caso de no detectar ctDNA. En este caso es importante el seguimiento y el contexto con todos los demás estudios imagenológicos en un comité de tumores multidisciplinario.

Aún, en Argentina, es incipiente el cambio de las decisiones terapéuticas clínicas oncológicas basadas en estas determinaciones, actualmente pueden estar acotados a ensayos clínicos particulares en donde las muestras se envían al exterior y son interpretadas en ese contexto, o también dentro de programas de testeo puntuales en donde se ofrece la detección de variantes específicas de resistencia (ya previamente reportadas por la bibliografía) a tratamientos dirigidos en donde puede significar que el tratamiento no está haciendo efecto. Esta determinación se puede realizar con sonda específica buscando cambios conocidos previamente donde solo se informa si esa variante está presente o no, y esto habitualmente se resuelve con una PCR en tiempo real o con una digital droplet PCR.

La práctica clínica está empezando a solicitar estos test, aún muy costosos, en el campo de las tumor uninformed ya sea al diagnóstico de la enfermedad avanzada o luego de haber agotado las primeras líneas de tratamientos estándar por fuera de los ensayos clínicos cuando es difícil acceder a una biopsia de tejido. En general, la primera aplicación de este campo sólo se está dirigiendo para los tumores de pulmón de células no pequeñas en donde hay una gran cantidad de variantes para seleccionar tratamientos, aunque ya se está empezando a expandir a otros tipos tumorales.

¿Cuáles son las condiciones preanalíticas para este tipo de análisis y sobre qué muestras se realiza? ¿Cómo se interpretan los resultados?

Como toda tecnología incipiente aún no está del todo estandarizado pero sí sabemos que si queremos separar plasma para poder extraer el ADN libre de células y la muestra de sangre entera fue tomada con un tubo de hemograma de 10ml de uso habitual K2EDTA, sabemos que lo tenemos que procesar en el momento, no se puede dejar para el otro día ni congelar y descongelar luego. La recomendación principal es congelar el plasma (siempre de 3 a 5 ml como mínimo) a -80C. De no poder procesar la muestra en el mismo momento de la extracción, se recomienda utilizar tubos especiales para conservar las células que pueden aportar DNA, en este caso contaminante, como los de la serie blanca. De usar estos tubos con conservante la muestra puede estar a temperatura ambiente al menos por 48hs a 72hs en principio.

Los resultados se deben interpretar siempre con el contexto clínico. Por ejemplo, no se puede mencionar una muestra de biopsia líquida con resultado negativo para una variante en particular, por ejemplo: KRAS G12X, como "wild type" como habitualmente se reporta cuando uno no encuentra una variante en una muestra de ADN de tejido, sino que se debe reportar como "no detectable".

¿En qué tipo de tumores es aplicable esta tecnología y con qué beneficios? ¿Es aplicable al seguimiento del tratamiento de cáncer de colon?

Actualmente el tipo de tumor más beneficiado y en donde ha encontrado su lugar de manera rápida es en cáncer de pulmón de células no pequeñas. Actualmente estamos trabajamos para poder implementar estas tecnologías en cáncer de colon metastásico, en principio para saber si es pronóstico encontrar alguna variante conocida previamente (tumor informed) en plasma antes de empezar un tratamiento de enfermedad avanzada, o para saber si podemos cambiar la práctica actual sobre sí es posible tratar un colon derecho super wild type (hiper seleccionado con test de biopsia líquida por NGS) si no encontramos ninguna de las variantes reportadas en esta instancia.

¿Es una tecnología de alto costo? ¿Cuál es su sensibilidad y especificidad?

Sí, hoy en día es una tecnología de alto costo, aún bastante más costosa que una determinación habitual de biología molecular. En general la sensibilidad máxima reportada es de 1 macromolécula proveniente del tumor (en general ADN) detectada en plasma por sobre 10000 moléculas totales. En cambio en la especificidad es en donde aún no sabemos por ejemplo, si un resultado "negativo" o "no detectable" implica siempre que el paciente no tiene enfermedad y no hay que tomar decisiones clínicas de tratamiento. Por el momento le falta maduración a la tecnología para la implementación clínica. Aún hoy forma parte de las discusiones habituales si está lista para el "prime time".

¿Todos los tumores pueden liberar ADN tumoral u otros biomarcadores a la circulación o bien a otros líquidos biológicos?

Todos los tumores pueden liberar ADN tumoral u otros biomarcadores a la circulación y a otros fluidos corporales como por ejemplo la detección de variantes de tumores uroteliales en la orina. Siempre depende del estadío tumoral, del momento terapéutico y del contexto clínico. La pregunta siempre es: ¿qué decisión clínica me va a ayudar a tomar este test de biopsia líquida? Además de que hay tumores donde la liberación de macromoléculas tumorales al torrente sanguíneo o "shedding" está más presente como puede ser el caso del cáncer colorrectal, o contrariamente, en el caso de los adenocarcinomas ductales pancreáticos donde es necesario tener mucho volumen tumoral para detectar cfDNA (cell-free DNA). En general para cualquier determinación de biopsia líquida se necesitan al menos 10 ng totales de cfDNA. No es una tarea fácil.

¿Existen controles de calidad y armonización de métodos?

Existen controles de calidad pero de agencias del exterior como la CAP y EMQN. No están del todo distribuidas en nuestro país. En general los laboratorios que ofrecen estas determinaciones a la práctica habitual participan de estos programas de control de calidad externo.

¿Qué futuro le augura a esta tecnología del laboratorio?

Le auguro un futuro promisorio en donde este tipo de determinaciones moleculares tenga un rol central en la mesa decisiones clínicas oncológicas a través de comités molecular de tumores en donde la interdisciplina tenga un rol central y la biopsia líquida pueda ayudar por ejemplo a elegir un tratamiento dirigido a una variante, o evaluar el éxito a un tratamiento y/o planificar su seguimiento, o decidir si intensificar la quimioterapia por haberse anticipado más de 6 meses a la recaída en comparación con una imagen (CT scan o RMN).

Si bien sus aplicaciones son muy relevantes y estimulantes, aún no está lista para ser implementada al 100%, primero si estas determinaciones son excesivamente costosas y no pueden beneficiar a todos los pacientes que lo necesitan, seguiremos siempre persiguiendo de atrás la promesa de la medicina de precisión en donde solo algunos pocos puedan acceder y beneficiarse, segundo aún no está claro cuál será su lugar en la implementación dentro de la práctica clínica, si al diagnóstico, si a la recaída, si un test o dos test son los correctos, si tumor uninformed primero y luego tumor informed como seguimiento.