RT-qPCR sin extracción de ARN para detección de SARS-CoV-2


Protocolo sin extracción que combina proteinasa K e inactivación por calor para la detección de SARS-CoV-2 mediante RT-qPCR. Genoud V, Stortz M, Waisman A, Berardino BG, Verneri P, Dansey V, Salvatori M, Remes Lenicov F, Levi V. PLoS One. 2021; 16(2):e0247792.


Resumen


La PCR con transcripción inversa en tiempo real (RT-qPCR) es la técnica estándar de oro para la detección del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) en muestras de hisopados nasofaríngeos. El análisis por RT-qPCR suele requerir un paso de extracción previo para obtener el ARN viral purificado. Desafortunadamente, la extracción de ARN constituye un cuello de botella para la detección temprana en muchos países, ya que es costosa, requiere mucho tiempo y depende de la disponibilidad de kits comerciales. Aquí, describimos un protocolo sin extracción para la detección de SARS-CoV-2 por RT-qPCR de muestras clínicas de hisopados nasofaríngeos en solución salina. El método incluye un tratamiento con proteinasa K seguido de inactivación por calor (método PK + HID). Demostramos que PK + HID mejora el rendimiento de RT-qPCR en comparación con el procedimiento de inactivación por calor. Además, mostramos que este protocolo sin extracción se puede combinar con una variedad de kits de multiplexación RT-qPCR. El método combinado con un kit de detección de multiplexación dirigido a genes virales N y ORF1ab mostró una sensibilidad de 0,99 y una especificidad de 0,99 a partir del análisis de 106 muestras clínicas positivas y 106 negativas. En conclusión, PK + HID es un procedimiento robusto, rápido y económico para determinaciones de RT-qPCR sin extracción de SARS-CoV-2.


Bibliografía


En inglés


1. Lalli MA, Langmade JS, Chen X, Fronick CC, Sawyer CS, Burcea LC, Wilkinson MN, Fulton RS, Heinz M, Buchser WJ, Head RD, Mitra RD, Milbrandt J. Rapid and Extraction-Free Detection of SARS-CoV-2 from Saliva by Colorimetric Reverse- Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification. Clin Chem. 2021;67(2):415-424


2. Beltrán-Pavez C, Alonso-Palomares LA, Valiente-Echeverría F, Gaggero A, Soto- Rifo R, Barriga GP. Accuracy of a RT-qPCR SARS-CoV-2 detection assay without prior RNA extraction. J Virol Methods. 2021; 287:113969.


3. Howson ELA, Kidd SP, Armson B, Goring A, Sawyer J, Cassar C, Cross D, Lewis T, Hockey J, Rivers S, Cawthraw S, Banyard A, Anderson P, Rahou S, Andreou M, Morant N, Clark D, Walsh C, Laxman S, Houghton R, Slater-Jefferies J, Costello P, Brown I, Cortes N, Godfrey KM, Fowler VL. Preliminary optimisation of a simplified sample preparation method to permit direct detection of SARS-CoV-2 within saliva samples using reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J Virol Methods. 2021;289:114048.


4. Lübke N, Senff T, Scherger S, Hauka S, Andrée M, Adams O, Timm J, Walker A. Extraction-free SARS-CoV-2 detection by rapid RT-qPCR universal for all primary respiratory materials. J Clin Virol. 2020;130:104579.


5. Chu AW, Chan WM, Ip JD, Yip CC, Chan JF, Yuen KY, To KK. Evaluation of simple nucleic acid extraction methods for the detection of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal and saliva specimens during global shortage of extraction kits. J Clin Virol. 2020;129:104519.


6. Klein S, Müller TG, Khalid D, Sonntag-Buck V, Heuser AM, Glass B, Meurer M, Morales I, Schillak A, Freistaedter A, Ambiel I, Winter SL, Zimmermann L, Naumoska T, Bubeck F, Kirrmaier D, Ullrich S, Barreto Miranda I, Anders S, Grimm D, Schnitzler P, Knop M, Kräusslich HG, Dao Thi VL, Börner K, Chlanda P. SARS- CoV-2 RNA Extraction Using Magnetic Beads for Rapid Large-Scale Testing by RT-qPCR and RT-LAMP. Viruses. 2020;12(8):863.


7: Dong L, Zhou J, Niu C, Wang Q, Pan Y, Sheng S, Wang X, Zhang Y, Yang J, Liu M, Zhao Y, Zhang X, Zhu T, Peng T, Xie J, Gao Y, Wang D, Dai X, Fang X. Highly accurate and sensitive diagnostic detection of SARS-CoV-2 by digital PCR. Talanta. 2021 ;224:121726.



En Español


1. Organización Panamericana de la Salud. Manual de procedimientos para el diagnóstico de laboratorio de las infecciones respiratorias agudas de etiología viral. 2003.


2. Peña López BO, Rincón Orozco B, Castillo León JJ. SARS-CoV-2: generalidades bioquímicas y métodos de diagnóstico. NOVA. 2020; 18 (35): 09-31.


3. Hernández A, Vasallo P, Torres A, Salido E. Análisis del RNA: Estudio de la expresión génica. NEFROLOGIA. Vol. XIV. Núm. 2:145-162.



Agudice su ingenio



figura

Figura:
La proteinasa K mejora el rendimiento del método de inactivación por calor en las determinaciones de RT-qPCR de SARS-CoV-2. (ab) Muestras de hisopado nasofaríngeo positivo (# 8, # 11, # 12, # 16, # 19, # 20) y negativo (# 1, # 2, # 3) se procesaron por inactivación por calor (HID), 98°C durante 5 min); tratamiento con proteinasa K seguido de inactivación por calor (PK + HID, 55°C durante 15 min y 98°C durante 5 min) o sometido a extracción de ARN (ARN purificado). Los genes virales N1 y N2 y el gen RNasa P (RP) humano se amplificaron y detectaron mediante RT-qPCR. (a) Valores de CT obtenidos del análisis RT-qPCR de las mismas muestras preparadas por los tres métodos diferentes. (b) Curvas de amplificación representativas para cada gen obtenido para una de las muestras positivas. (c) Eficiencias de amplificación (EPCR) y cantidad inicial de copias de amplicón (n) en muestras PK + HID en relación con las muestras HID correspondientes. La mediana de cada medición se representa con una línea en las barras y las longitudes de estas barras representan el error estándar. (d) Las muestras de frotis nasofaríngeos positivas se sometieron a tratamiento con diferentes concentraciones de proteinasa K (PK) seguido de inactivación por calor (55 ° C durante 15 min y 98 ° C durante 5 min). Los genes virales N1 y N2 y el gen RP humano fueron amplificados y detectados por RT-qPCR. CT representa la diferencia media entre los valores de CT obtenidos en cada condición analizada y los correspondientes a las muestras HID. Se representan los valores medios ± SEM (N = 5).


(HID: “heat-inactivation” inactivación por calor;
PK: proteinasa K;
CT: “cycle threshold “o “Threshold point” o ciclo umbral).


Actividad interactiva


Luego de la observación de la figura lo invitamos a responder:
a- Indique con una cruz ¿Cuál de los genes virales amplificados tienen mayor eficiencia de amplificación?.


tabla1

b- Del análisis de las curvas de amplificación indicar el orden de eficiencia de la PCR (E PCR ) en orden creciente.


tabla2


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