BISFENOL A: UN DISRUPTOR ENDOCRINO DETECTADO EN SANGRE DE CORDÓN


Cuantificación de Bisfenol A (BPA) libre en sangre de cordón umbilical humano a nivel de trazas*.

Cases GG, Calinski GJ, Méndez ML, Vidal FA, Otaño L, Mariani GL, Figar S, Giménez MI. | * Resumen del trabajo científico publicado en Acta Bioquím Clín Latinoam 2018; 52 (1): 89-96.

El BPA es el ingrediente principal en la producción de policarbonatos, poliéster insaturado, resinas de polisulfona y epoxi. El BPA está presente en productos de usos cotidianos y masivos. Es un mimético estrogénico, imita la acción del 17 beta estradiol con una potencia similar. Se le ha designado como un Disruptor Endocrino, incidiendo en el desarrollo gonadal y del sistema nervioso central.


La dieta es la principal fuente de exposición en humanos. El BPA en los alimentos, está relacionado con el tiempo de almacenamiento en envases de plástico y en otros factores físicos.


Se ha detectado en suero materno, placenta, líquido amniótico, suero de cordón umbilical y en hígado fetal.


En adultos se metaboliza por uridinadifosfatoglucuroniltransferasa, enzima inactiva en el hígado fetal. En la placenta la beta glucuronidasa hidroliza el conjugado y aumenta la exposición fetal.


El BPA libre representa la forma mimética estrogénica por lo que resulta importante su cuantificación en sangre de cordón.


El objetivo del presente trabajo fue validar un método por cromatografía liquida de alto rendimiento en tándem con espectrometría de masa (UPLC-ESI-MS/MS) usando un isótopo deuterado de BPA como estándar interno (BPA-d16) para la detección de trazas de BPA libre en plasma de cordón umbilical.


MÉTODOS Y MATERIALES


El BPA y BPA-d16 se prepararon en una solución de BPA de 0,1 mg/mL en metanol (solución de reserva). Por diluciones seriadas en metanol del BPA se preparó la curva de calibración en el rango de 1,1 a 12,0 ng/ml. Se prepararon 3 controles de calidad (QC) alto, medio y bajo de 10,0, 5,6 y 3,3 ng/mL respectivamente. De la solución de reserva del BPAd-16 se preparó por dilución con acetonitrilo un estándar interno a la concentración de 10,2 ng/mL.


Las muestras de sangre del cordón umbilical (n:390) se colectaron en el momento del nacimiento en tubos con EDTA K3 y el plasma se mantuvo a -20 grados C, permaneciendo estable por más de 20 años.


El procedimiento se realizó en el laboratorio del Hospital Italiano de Buenos Aires. Se agregó a 225 µl de plasma, 900 µl del estándar interno, se centrifugó y 3 µl del sobrenadante se inyectaron al UPLC-MS-MS por un auto muestrador. La cromatografía se realizó en una columna de Acquity-UPLC, la fase móvil fue agua: acetonitrilo (50:50) y el flujo 0,4 ml/min. La concentración de BPA fue medida por interpolación en la curva de calibración de la relación del área del analito del pico entre el analito y su estándar interno.


La evaluación de la contaminación de BPA se realizó en el ambiente analítico y en los materiales empleados para preparar los blancos, así como en los crioviales, puntas de pipetas y viales del auto muestrador. En todos los casos los resultados fueron negativos.


VALIDACIÓN DEL MÉTODO


Selectividad: El método permite diferenciar BPA y el estándar interno de otros componentes plasmáticos. No se observó pico de BPA en el blanco (plasma normal + estándar interno). Linealidad: límite de detección y cuantificación. Se obtuvo linealidad de la curva estándar entre 1,1 y 12,0 ng/mL, con un coeficiente de correlación mayor a 0,99. Los límites de detección y cuantificación (relación señal /ruido), para 225 µl de plasma fueron de 0,6 ng/mL y 1,1 ng/m. Exactitud y precisión intra-día: Se determinó por quintuplicado con las muestras de los 3 niveles de QC, repitiéndose el procedimiento 5 días. La exactitud:Error Relativo Porcentual (ER%) representa el % de desviación de la concentración medida con respecto a la concentración nominal en cada nivel. La precisión se expresó como el coeficiente de variación porcentual (CV%). La precisión exactitud intra e inter día deben ser menores del 15 %.


ANÁLISIS DE DATOS Y ESTADÍSTICA


Las tablas de cuantificación (tiempos de retención, valores del área de señal y concentración para cada variable) fueron generadas con el sofware Targetl 4.1. La relación lineal entre área, por regresión de mínimos cuadrados ponderables. Los resultados se presentan como media±DE. Para la muestra baja de GC el CV% intra e inter día fueron 7,5 y 7,18, respectivamente y el ER% 8,43 y 8,32, respectivamente. Para la concentración media el CV% intra e inter día fueron 3,67 y 5,71, respectivamente y el ER% 5,71y 5,22, respectivamente. Para la concentración alta el CV% intra e inter día fueron 4,00 y 3,21, respectivamente y el ER% 10,33 y 11,08, respectivamente.


VALORES DE BPA LIBRE EN PLASMA DE CORDÓN UMBILICAL


Se detectó en 20 de las 390 muestras (5.1%) niveles entre 0,6 y 12,0 ng/ml. En 2 de estas 20 muestras se obtuvieron valores superiores a 12,0 ng/ml, que corresponde al límite superior de detección.


DISCUSIÓN.


Dado que el BPA es un contaminante presente en numerosos materiales del laboratorio, así como en algunos solventes y aun en el agua ultra pura, el principal problema de su determinación es identificar y eliminar o minimizar esta contaminación. Vale decir, el sentido de este estudio es valorar los niveles reales de BPA en sangre y tejidos humanos. La descripción metodológica de este estudio, permitió demostrar que las posibles contaminaciones de BPA fueron minimizadas no influyendo significativamente en su valoración.


Los valores de BPA obtenidos en este trabajo fueron de 3,69±3,55 ng/ml con un rango entre 1,1 y 12,0 ng/mL. Comparados con otros países, la diferencia fue muy amplia (<0,6 y 2,18 ng/mL). Esta diferencia también se presentó empleando el mismo método, por ejemplo UPLC MSMS en 3 laboratorios fueron 3,69±3,55, 2,18±8,10 y < 0,6 ng /ml, respectivamente.


En resumen, se describe un método rápido, sensible y selectivo que emplea un simple pre tratamiento. Debe tenerse en consideración evitar el uso de plásticos en las diferentes etapas del proceso. Es importante que se cuantifique BPA en sangre de cordón umbilical para evaluar la exposición fetal al mismo y sus posibles efectos tóxicos.


Se podrá acceder al artículo completo Cuantificación de Bisfenol A (BPA) libre en sangre de cordón umbilical humano a nivel de trazas publicado en Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana desde www.scielo.org.ar, ingresando al volumen 52, Nro. 1 de 2018.
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